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送样建议

细胞因子

声明:
实验室不接收《人间传染的病原微生物名录》(点击查看)的所有样品。对于高毒性动植物等样品,必须事先通过销售、客服或运营经理与J9九游会技术人员联系,确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
提取风险提示和注意事项:核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系,尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响,因此较难保证单次提取满足质量要求,客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸,请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本,建议自行提取。取样过程中,需要全程佩戴手套,并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒,以免样本污染

1. 收样前注意事项

收集样品前必须有一个完整的计划,必须清楚要检测的成份是否足够稳定。我们提倡新鲜样品尽早检测,如需要周期收集样品,请取材后,将样品及时分装保存于-80°C。冻融易引起蛋白降解,直接影响实验质量,请避免反复冻融。目前不接受感染性疾病样品(如 HIV 血样等)的检测。

2. 寄送样本类型

液体类样本:包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、细胞裂解液、组织匀浆等。
  • 2.1 血清

    1)血液收集在离心管或真空采血管中(不含抗凝剂、防腐剂或者分离剂)室温静置 30-60 min或 4°C 过夜;
    2)1,500 rpm,离心 15 min,仔细收集上清;
    3)分装保存,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
    注意:采血时请使用不加抗凝剂的真空采血管(红色盖头)。血清参考得率:30%-50%。避免溶血。
  • 2.2 血浆

    1)使用含有 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂的抗凝管采集血样;
    2)采集 30 min 内,2,000 rpm,离心 15 min。仔细收集上清;
    3)分装保存,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
    注意:推荐使用 EDTA 抗凝管(紫色头盖)。需提前与销售沟通查清所需使用试剂盒对抗凝剂是否有特殊要求。血浆参考得率:约 50%。
  • 2.3 尿液

    1)用无菌管收集晨起中段尿;
    2) 2,000 rpm,离心 20 min;
    3) 仔细收集上清,分装保存。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
  • 2.4 脑脊液、胸腹水

    处理及保存方法与尿液处理及保存方法相同。
  • 2.5 细胞培养上清

    1)检测细胞分泌性成份时,用无菌管收集上清;
    2) 2,000 rpm,离心 20 min;
    3)仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
    注:血清中含有部分细胞因子,所以建议制备无血清或低血清条件培养基。例如,于培养皿或培养板中加入完全培养基,接种细胞;细胞贴壁后,加入含药物的6- 8 ml无血清或低血清(低于2%胎牛血清)培养基作用细胞;待药物作用时间点到达时,确保细胞数目足够多(数量约为106-107 ),收集培养上清于15ml离心管中,2000rpm、4℃离心10min,收集上清,分装于1.5 mL EP管,储存于- 80℃中。
  • 2.6 细胞裂解

    可选用以下几种方法获得细胞裂解液:
    2.6.1 化学试剂裂解法
        1)检测细胞内成份时需对细胞样本进行裂解。贴壁细胞需要先用胰酶消化后收集,悬浮细胞可直接收集至离心管中;
        2)待药物作用时间点到达时,确保细胞融合度达到90%以上(数量约为106–107 ),1,500 rpm 离心 10 min,吸弃上清;
        3)用PBS (4℃)清洗2次细胞,加入 NP40 或者 RIPA 裂解液裂解细胞(150-200μl细胞裂解液,或者参照您购买的裂解液说明书),13,000 rpm 离心 20 min。
        4)仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
        5)建议裂解蛋白浓度至少2mg/ml以上,上样时稀释倍数约5-10倍,上样浓度建议为500ug/ml。
    注意:
        1)裂解液成份中推荐使用非离子型去垢剂,如 Triton X-100、NP-40 等;
        2)Triton X-100、NP-40 终浓度不宜超过 2%;
        3)避免使用叠氮钠;
        4)裂解液内还原剂如β-巯基乙醇、DTT 等终浓度不宜超过 10 mM;
    推荐的裂解液:
    RIPA Buffer
    Tris pH 7–8 25mM
    NaCl 150 mM
    SDS 0.1% (w/w)
    sodium deoxycholate 0.5% (w/w)
    Triton X-100 or NP-40 1% (w/w)
    Protease inhibitors such as PMSF or cocktail protease inhibitors. Phosphatase inhibitors if relevant
    2.6.2 反复冻融法
        1)用 PBS 稀释细胞悬液,细胞浓度达到 1×106/ml 左右;
        2)通过反复冻融(-20°C 冰冻,室温溶解,反复 3 次),使细胞破裂释放出细胞内成份;
        3)13,000 rpm 离心 20 min;
        4)仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
        5)建议裂解蛋白浓度至少2mg/ml以上,上样时稀释倍数约5-10倍,上样浓度建议为500ug/ml。
    2.6.3 超声破碎法
        1) 取适量 PBS 重悬细胞,用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂释放出细胞内成份;
        2) 13,000 rpm 离心 20 min;
        3) 仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
    细胞裂解步骤:
        1)将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用,用蒸馏水或者双蒸水稀释。
        2)配制Protease Inhibitor Cocktail:将Protease Inhibitor Cocktail(蛋白酶抑制剂)小管简单离心,然后将盖子打开,加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中,混匀溶解蛋白酶抑制剂。
        3)取20ul配制好的蛋白酶抑制剂,加入到1980ul的1X Cell Lysis Buffer中,混匀,即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞裂解液,备用。
        4)将配制好的2ml细胞裂解液和1X PBS 在冰上预冷;
        5)将细胞板放在冰上进行细胞裂解;
        6)用1xPBS将细胞清洗3次,弃去1X PBS,最后一次要彻底吸干1X PBS;
        7)加入100-200ul裂解液,然后将细胞刮下来,收集到EP管中;
        8)将EP管在冰上放置30min,每隔5-10min涡旋摇匀30s;
        9)冷冻离心机离心14000rpm 10min;
        10)取上清,分装后在-80度冻存,避免反复冻融;
        11)干冰邮寄
    PS:也可以将悬浮细胞离心收集细胞沉淀,然后加适量裂解液进行裂解;
    蛋白酶抑制剂可以使用商业化的蛋白酶抑制剂,按照说明书配制即可;
    或者使用2M PMSF蛋白酶抑制剂: 取6.968 g PMSF溶解在200 ml 酒精(100%),然后稀释400倍使用。
    采用蛋白定量试剂盒定量制备的细胞裂解液,蛋白浓度至少大于5mg/ml。
  • 2.7 组织匀浆

    (1)切割样本后,称取重量,如果组织上有血液残留,用预冷生理盐水或 PBS 洗净;
    (2)加入一定量的 NP40 或者 RIPA 裂解液,建议20 mg - 100 mg 组织加入500μl裂解液(或者参照您购买的裂解液说明书),液氮迅速冷冻保存备用; 组织裂解步骤:
      一 裂解液的配制
        1)将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用,用蒸馏水或者双蒸水稀释。
        2)配制Protease Inhibitor Cocktail:将Protease Inhibitor Cocktail(蛋白酶抑制剂)小管简单离心,然后将盖子打开,加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中,混匀溶解蛋白酶抑制剂。
        3)取20ul配制好的蛋白酶抑制剂,加入到1980ul的1X Cell Lysis Buffer中,混匀,即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞/ 组织裂解液,备用。
    注:蛋白酶抑制剂可以使用商业化的蛋白酶抑制剂,按照说明书配制即可;或者使用2M PMSF蛋白酶抑制剂: 取6.968 g PMSF溶解在200 ml 酒精(100%),然后稀释400倍使用。
      二 组织裂解
        4)将配制好的细胞/ 组织裂解液和1X PBS 在冰上预冷;
        5)从-80度冰箱取出冰冻组织,取100 mg组织,用手术剪刀将其剪碎至1-3 mm6,转移至2ml离心管,加入200ul细胞裂解液,置冰上保持低温,匀浆机裂解组织,30s-5min(根据具体组织而定)。
        6)冷冻离心机离心14000rpm 10min;
        7)取上清,分装后在-80度冻存,避免反复冻融;
        8)干冰邮寄
      注:采用蛋白定量试剂盒定量制备的组织裂解液,蛋白浓度至少大于5mg/ml。
  • 2.8 粪便提取液

    1)使用液氮对粪便样品进行速冻;
    2)解冻后将样品均化,并将 50 至 100 mg 样品转移到离心管中(离心管事先称重);
    3)通过称重确定粪便的质量,加入样品稀释剂,稀释比例 1:20;
    4)使用涡旋混合管内容物,使用并以 3,000 g 离心 10 min。
    5)收集上清液并测试毒素。
  • 2.9 外泌体

    可选用以下几种方法提取外泌体:
    2.9.1 差速离心法
        1)收集细胞上清或生物液体放入离心管中,300g,4°C离心10min,去除细胞,收集上清;
        2)收集的上清2,000g,4°C离心20min,去除细胞和死细胞,收集上清;
        3)收集的上清10,000g,4°C离心30min用以去除细胞碎片,收集上清;
        4)收集的上清100,000g,4°C离心70min,去除上清,收集沉淀(外泌体的粗提物);
        5)将沉淀在冷的PBS缓冲液中重悬,100,000g,4°C离心70min,去除上清;
        6)将沉淀用50-100?L的冷的PBS重悬,100,000g,4°C离心70min,将上清去除,再沉淀用20-50?L的冷的PBS重悬;
        7)-80°C冻存。
    可选方法:细胞培养上清或生物液体300g,4°C离心10min。收集上清并用0.22?m的过滤器过滤去除细胞碎片等污染物。然后100,000g,4°C离心70min,收集沉淀得到外泌体的粗提物。各管用1mL冷的PBS缓冲液悬起并汇集到一起。再次100,000g,4°C 离心70 min,去除上清后用 500 ?L 冷的 PBS 缓冲液悬起,分装 100 ?L/管,-80°C 冻存。
    2.9.2 蔗糖密度梯度法
        1)取35mL培养完的带有细胞的培养基,300g离心10min去除细胞重复一次;
        2)将第一步得到的上清再依次以1,200g离心10min两次,10,000g离心30min,70,000g离心60min,去上清;
        3)获得的沉淀用5mL2.5M蔗糖,20mMHepes/NaOH,pH7.2的溶液重悬;
        4)线性蔗糖梯度(2-0.25M蔗糖,20mMHepes/NaOH,pH7.2)层叠在外泌体的悬浮液上方,10,000g离心15h;
        5)吸取带有外泌体的蔗糖密度梯度带后,用PBS稀释到3mL,200,000g,4°C离心60min;
        6)去上清,用50-100?LPBS重悬得外泌体。
    2.9.3 免疫磁珠法
        1)前面按细胞培养基准备方法操作,将培养基转移到50mL离心管中,2,000g,4°C离心10min;
        2)将培养基转移到新的50mL离心管中,再次离心;
        3)将磁珠加入到50mL离心管中并加入足量的特定抗体室温静置30min;
        4)利用磁力分离器吸住磁珠并将50mL离心管中的液体排出,从磁力分离器中取出带有磁珠的50mL离心管并加入PBS清洗磁珠两次,得到免疫磁珠;
        5)将第二步得到的培养基加入到带有磁珠的50mL离心管,4°C静置2h;
        6)将50mL离心管放入磁力分离器中移除液体,此时外泌体已吸附在免疫磁珠表面;
        7)用PBS清洗免疫磁珠两次,得到的磁珠外泌体复合物进行后续的分离实验。
    2.9.4 尺寸排阻法
        1)500?L细胞培养基(1,500g离心10min)或者1mL处理过的血浆(10,000g离心20min)过qEV尺寸排阻柱子,用PBS洗脱;
        2)每500?L收集到一起,颗粒和蛋白大小分别用TRPS和Bradford测定;
        3)细胞培养基中,高颗粒/低蛋白的组分汇集到一起,并用AmiconUltra-410kDa装置处理到终体200?L(血浆样品先用0.22?m滤器过滤,再进行同样的操作。
    2.9.5 聚合物(PEG)沉降法
    预处理:先将培养物离心去除细胞和碎片,上清用0.22?m滤膜过滤后进行后续实验。
        1)25gPEG(10kDa)在50mL去离子水中超声1h获得均相溶液。PEG溶液在4°C,5,000g离心20min。上清用0.22?m滤膜的注射器过滤作为母液(50%,g/mL)备用;
        2)适量PEG母液与培养物混合成PEG终浓度为10%,4°C孵育30min;
        3)3,000g离心10min,将上清尽量去除,收集外泌体的沉淀;
        4)为了进一步去除残留的血清蛋白或污染蛋白,用PBS悬浮外泌体沉淀;
        5)PEG母液再次加入至终浓度为10%,4°C孵育30min;
        6)4°C,3,000g离心10min;
        7)尽量去除上清,收集沉淀用PBS重悬得外泌体,用于后续实验。
    2.9.6 试剂盒提取
    可选试剂盒:101Bio试剂盒、OptiPrepTM试剂盒、ExoQuickTM试剂盒、ExoQuickTM试剂盒、Exo-spinTM试剂盒
    外泌体提取后,按照1:1加入M-PER(ThermoScientific)裂解液,裂解10min,分装保存于-80°C。

3. 样本需求量

产品 样本需求量 备注
Luminex 50μL/孔,如果要做预实验,需要另外单独准备50μL 1.为避免反复冻融影响样本质量,建议您将预实验样本与正式实验样本分开装
2.客户可以随机挑选其中 3 个样本做预实验

半定量玻璃或定量芯片样本需求量
芯片系列 组织 裂解液 血清血浆 上清 其它体液 细胞 试剂盒举例
单张玻璃 G1-10, Q1-24 20mg 2.5mg/ml以上, 24ul, 总蛋白量60ug 60ul 不浓缩120ul, 浓缩10倍1.2ml 60ul 1x106 AAH-CYT-G10, QAH-CYT-1
2张玻璃 G1000, Q1000 30mg 2.5mg/ml以上, 48ul, 总蛋白量120ug 120ul 不浓缩220ul, 浓缩10倍2.2ml 120ul 2x106 AAH-CYT-G1000, QAH-CAA-1000
3张玻璃 G2000, Q2000 50mg 2.5mg/ml以上, 68ul, 总蛋白量170ug 170ul 不浓缩320ul, 浓缩10倍3.2ml 170ul 3x106 AAH-CYT-G2000, QAH-CAA-2000
4张玻璃 Q3000 50mg 2.5mg/ml以上, 88ul, 总蛋白量220ug 220ul 不浓缩420ul, 浓缩10倍4.2ml 220ul 4x106 QAH-CAA-3000, GSH-CAA-3000
5张玻璃 G4000, Q4000 50mg 2.5mg/ml以上, 108ul, 总蛋白量270ug 270ul 不浓缩520ul, 浓缩10倍5.2ml 270ul 5x106 AAH-CYT-G4000, QAH-CAA-4000
6张玻璃 Q5000, G5000 50mg 2.5mg/ml以上, 128ul, 总蛋白量320ug 320ul 不浓缩620ul, 浓缩10倍6.2ml 320ul 6x106 QAH-CAA-5000, GSH-CAA-5000
7张玻璃 Q6000, G6000 50mg 2.5mg/ml以上, 148ul, 总蛋白量370ug 370ul 不浓缩720ul, 浓缩10倍7.2ml 370ul 7x106 QAH-CAA-6000, GSH-CAA-6000
8张玻璃 Q7000, G7000 50mg 2.5mg/ml以上, 168ul, 总蛋白量420ug 420ul 不浓缩820ul, 浓缩10倍8.2ml 420ul 8x106 QAH-CAA-7000, GSH-CAA-7000
9张玻璃 Q8000, G8000 50mg 2.5mg/ml以上, 188ul, 总蛋白量470ug 470ul 不浓缩920ul, 浓缩10倍9.2ml 470ul 9x106 QAH-CAA-8000, GSH-CAA-8000
10张玻璃 Q9000, G9000 50mg 2.5mg/ml以上, 208ul, 总蛋白量520ug 520ul 不浓缩1020ul, 浓缩10倍10.2ml 520ul 1x107 QAH-CAA-9000, GSH-CAA-9000
11张玻璃 Q440, G440 60mg 2.5mg/ml以上, 228ul, 总蛋白量570ug 570ul 不浓缩1120ul, 浓缩10倍11.2ml 570ul 1.1x107 QAH-CAA-440, GSH-CAA-440
12张玻璃 Q480, G480 70mg 2.5mg/ml以上, 248ul, 总蛋白量620ug 620ul 不浓缩1220ul, 浓缩10倍12.2ml 620ul 1.2x107 QAH-CAA-480, GSH-CAA-480
13张玻璃 Q520, G520 80mg 2.5mg/ml以上,268ul, 总蛋白量670ug 670ul 不浓缩1320ul, 浓缩10倍13.2ml 670ul 1.3x107 QAH-CAA-520,GSH-CAA-520
14张玻璃 Q560, G560 90mg 2.5mg/ml以上,288ul, 总蛋白量720ug 720ul 不浓缩1420ul, 浓缩10倍14.2ml 720ul 1.4x107 QAH-CAA-560, GSH-CAA-560
15张玻璃 Q600, G600 100mg 2.5mg/ml以上,308ul, 总蛋白量770ug 770ul 不浓缩1520ul, 浓缩10倍15.2ml 770ul 1.5x107 QAH-CAA-600, GSH-CAA-600
16张玻璃 Q640, G640 110mg 2.5mg/ml以上,328ul, 总蛋白量820ug 820ul 不浓缩1620ul, 浓缩10倍16.2ml 820ul 1.6x107 QAH-CAA-640, GSH-CAA-640
25张玻璃 QX00 120mg 2.5mg/ml以上,508ul, 总蛋白量1270ug 1270ul 不浓缩2520ul, 浓缩10倍25.2ml 1270ul 2.5x107 QAH-CAA-X00

夹心法膜芯片样本需求量
芯片系列 组织 裂解液 血清血浆 上清 其它体液 细胞 试剂盒举例
单张膜 C1-10 30mg 2.5mg/ml以上, 208ul, 总蛋白量520ug 520ul 不浓缩1020ul, 浓缩10倍10.2ml 520ul 1x107 AAH-CYT-10
2张膜 C1000 50mg 2.5mg/ml以上, 408ul, 总蛋白量1020ug 1020ul 不浓缩2020ul, 浓缩10倍20.2ml 1020ul 2x107 AAH-CYT-1000
3张膜 C2000 60mg 2.5mg/ml以上, 608ul, 总蛋白量1520ug 1520ul 不浓缩3020ul, 浓缩10倍30.2ml 1520ul 3x107 AAH-CYT-2000
5张膜 C4000 100mg 2.5mg/ml以上, 108ul, 总蛋白量2520ug 2520ul 不浓缩5020ul, 浓缩10倍50.2ml 2520ul 5x107 AAH-CYT-4000

标记法玻璃芯片样本需求量
芯片系列 组织 裂解液 血清血浆 上清 其它体液 细胞 试剂盒举例
单张玻璃 L507, L493 20mg 2.5mg/ml以上, 12ul, 总蛋白量30ug 100ul 不浓缩1000ul, 浓缩10倍10ml 500ul 1x106 AAH-BLG-1, AAH-BLG-2
2张玻璃 L1000 50mg 2.5mg/ml以上, 24ul, 总蛋白量60ug 200ul 不浓缩2000ul, 浓缩10倍20ml 1000ul 2x106 AAH-BLG-1000
单张玻璃 L308 20mg 2.5mg/ml以上, 24ul, 总蛋白量60ug 100ul 不浓缩1000ul, 浓缩10倍10ml 500ul 1x106 AAM-BLG-1
单张玻璃 L90 20mg 2.5mg/ml以上, 24ul, 总蛋白量60ug 100ul 不浓缩1000ul, 浓缩10倍10ml 500ul 1x106 AAR-BLG-1
单张玻璃 L182 20mg 2.5mg/ml以上, 24ul, 总蛋白量60ug 100ul 不浓缩1000ul, 浓缩10倍10ml 500ul 1x106 AAH-BLG-ADI-1

标记法膜芯片样本需求量
芯片系列 组织 裂解液 血清血浆 上清 其它体液 细胞 试剂盒举例
单张膜 L507,L493 30mg 2.5mg/ml以上, 24ul, 总蛋白量60ug 200ul 不浓缩2500ul, 浓缩10倍25ml 1000ul 2x106 AAH-BLM-1, AAH-BLM-2
2张膜 L1000 50mg 2.5mg/ml以上, 36ul, 总蛋白量90ug 300ul 不浓缩5000ul, 浓缩10倍50ml 2000ul 4x106 AAH-BLM-1000
单张膜 L308 30mg 2.5mg/ml以上, 24ul, 总蛋白量60ug 200ul 不浓缩2500ul, 浓缩10倍25ml 1000ul 2x106 AAM-BLM-1
单张膜 L90 20mg 2.5mg/ml以上, 24ul, 总蛋白量60ug 100ul 不浓缩1000ul, 浓缩10倍10ml 500ul 2x106 AAR-BLM-1
单张膜 L182 20mg 2.5mg/ml以上, 24ul, 总蛋白量60ug 100ul 不浓缩1000ul, 浓缩10倍10ml 500ul 2x106 AAH-BLM-ADI-1

4. 注意事项:

1)样本在检测前必须保存在-80 度冰箱,且未经过反复冻融(建议使用从未解冻或只解冻过一次的样本)。乙方无技术手段判断样本是否经过反复冻融且无法质控,甲方需要确保样本满足此要求。
2)甲方需要使用足量干冰在工作日将样本送至乙方工作地址,保证样本在到达乙方处仍处于冰冻状态。
3)为了保证最好的实验结果,甲方需确保提供的样本不存在血纤维蛋白、血红细胞及其它不溶沉淀物质。乙方在未经甲方同意的情况下不接受使用具有严重溶血的样本。
4)常规血清、EDTA 管采集的血浆样本,甲方提供每个样本的样本量 200ul/检测项目,如同一样本需要完成多个蛋白检测,按每检测项目 200 ul 进行总送样体积叠加。若甲方要求样本做三个重复,使用的样本量需要与乙方确认。若甲方提供的样本量无法达到乙方的最低要求,或是样本类型较为特殊,需提前告知乙方并由双方共同评估实验可能及对应风险。
5)甲方不得在知晓的情况下,提供具有传染性或受严格管控的样本。例:艾滋病病人的血清、血浆样本。若甲方需要对此类项目进行检测,乙方可以协助甲方共同寻找具有相关实验条件的公司。此类项目将不进入此合作协议范畴。
6)甲方需要支付样本到达乙方的物流、干冰费用,相应运输风险亦由甲方承担。如遇甲方需要乙方对剩余样本进行返样至甲方客户处,收样方需支付乙方干冰费用 200 元/次,由甲方在每月的款项结算日时统一结算给乙方。若无特殊情况,乙方将默认选择“顺丰快递到付”的物流服务。
7)甲方提供的单次实验样本量需要满足至少一个试剂盒或其整倍数的样本量。
8)甲方如果提前知晓检测样本存在高浓度或极低浓度的可能,需要提前告知乙方样本是否需要稀释。否则,乙方在甲方未告知的情况下,将对样本按仪器推荐的稀释倍数进行上机,由此导致的后果由甲方承担。对特殊样本,甲乙双方需在实验前对样本前处理方案进行讨论,达成共识后进行实验。
其他未尽信息,请详询质谱事业部 ms@novogene.com。

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