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送样建议

外泌体非编码RNA测序

声明:
实验室不接收《人间传染的病原微生物名录》(点击查看)的所有样品。对于高毒性动植物等样品,必须事先通过销售、客服或运营经理与J9九游会技术人员联系,确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
提取风险提示和注意事项:核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系,尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响,因此较难保证单次提取满足质量要求,客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸,请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本,建议自行提取。取样过程中,需要全程佩戴手套,并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒,以免样本污染。

1 血浆/血清样品

样本类型 送样量/库 样本保存和运输
血浆/血清 4-5 ml 寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中,防止样本运输过程中被破坏;液氮速冻,干冰运输。
血浆样品样本制备方法:
(1)用含有EDTA(紫头管)的5ml采血管抽取全血,共需10ml。轻柔上下颠倒混匀(离心条件限制时可将全血样本置于4°C保存,1h内进行下一步处理);
(2)4°C,使用吊桶式转头1900g离心10min,小心吸取上清即为血浆,最后500μl丢弃;
(3)得到的血浆再次离心,在4°C,3000g的条件下离心15min,小心吸出血浆,注意不要碰到底部和侧面的沉淀物;
(4)将血浆分装到EP管中,送样前可冻存于-80°C,避免反复冻融;
注意:统一早晨空腹采血,尽量避免样本间的差异影响;不能用肝素抗凝管,因为肝素会影响后续的酶反应。
血清样本制备方法:
(1)采用采血针和普通血清管(不含抗凝剂的5ml采血管(红头管))采血10ml;
(2)室温静置30min后,然后4°C下静置3-4h(此时可见血块析出);
(3)用移液器吸取上面的淡黄色血清(应该有4ml左右)转入15ml离心管中,4°C条件下3000g离心15min,小心取上清转入新的15ml离心管中,最大程度保证血清质量;
(4)离心后的血清15min内冻存于-80°C冰箱,避免反复冻融。
注意事项:
(1)分离exosomes前,不能加入任何RNA保护剂(如Trizol,RNA later);
(2)若非研究血小板来源外泌体,请尽量采用血浆送样;
(3)统一早晨空腹采血,尽量避免样本间的差异影响;
(4)采血后避免剧烈振荡,防止溶血,溶血后需重新采样;
(5)全血不可冻融,取血后尽早制备血浆/血清;
(6)不能用肝素抗凝管,因为肝素会影响后续的酶反应。

2 细胞上清样品

样本类型 送样量/库 样本保存和运输
细胞上清 30ml 寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中,防止样本运输过程中被破坏;液氮速冻,干冰运输。
细胞上清本制备方法:
(1)细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间,贴壁细胞密度在70%-80%(相对于培养皿的面积,长满为100%,肉眼判断),悬浮细胞密度在60%-70%(相对最大浓度来说,具体依据经验判断);
(2)贴壁细胞要去除原有培养基,换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基培养;悬浮细胞在300g,4°C的条件下离心10min收集细胞;
(3)使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养。细胞继续培养24-48h,根据细胞的生长速度确定收取上清时间细胞上清收集时间(培养基变黄可能培养的时间太长);
(4)收集细胞上清,300g,4°C,离心10min;小心吸取上清,注意避免吸入细胞或者细胞碎片;
(5)3000g,4°C,再次离心15min,确保将细胞或者细胞碎片去除干净;
(6)取上清,注意避免吸入细胞或者细胞碎片,合并相同的细胞培养液上清样品,装入50ml离心管中,可在4°C短期保存(1-2天),长期保存可冻存于-80°C。
注意事项:
(1)细胞培养基必须使用去除外泌体的血清或者无血清培养基;
(2)细胞无衣原体、支原体及其他微生物污染,否则可能影响后续数据质量。请送样前确认本样本无微生物污染。若无法确认,公司提供支原体衣原体检测服务;
(3)如果提供的是冻存细胞株,需提供详尽的复苏方法。
(4)细胞上清分离后尽快进行外泌体分离,保存在4°C和-80°C,都会对外泌体形态质量有一定的影响。

3 尿液样品

样本类型 送样量/库 样本保存和运输
尿液 30ml 寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中,防止样本运输过程中被破坏;液氮速冻,干冰运输。
尿液样品制备方法:
(1)采集前/中后段晨尿,应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液,并注意避免细菌污染,收集前注意饮食控制,于4°C临时保存(不超过8h);
(2)用15ml或50ml离心管收集尿液,300g,4°C离心10min,将上清转移至干净离心管中,避免碰触底部沉淀;
(3)3000g,4°C离心15min,去除细胞或细胞碎片,保留上清,避免碰触到底部沉淀;送样前可冻存于-80°C,避免反复冻融。
注意事项:
(1)收集尿液时,应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液;
(2)采集晨尿,或6 h以上未排尿亦可;无其他微生物污染。

4 其他常见样品

样本类型 送样量/库 样本保存和运输 注意事项
胸水/腹水 40ml 寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中,防止样本运输过程中被破坏;液氮速冻,干冰运输。 请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集脑脊液。
脑脊液 20ml
胆汁 15ml
胸水样本制备方法:
(1)临床收集胸水后若不能第一时间处理,请于4°C临时保存(不得超过8h);
(2)将收集到的胸水1000g离心10min,收集上清液;
(3)将得到的胸水上清3000g离心10min,收集上清,-80°C保存。
腹水样本制备方法:
(1)临床收集腹水后若不能第一时间处理,请于4°C临时保存(不得超过8h);
(2)将采集的腹水在4°C下(室温亦可)离心2000g,20min,去除腹水残渣;-80°C保存。
脑脊液样本制备方法:
(1)收集脑脊液10ml(请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集脑脊液),避免受到血液污染;采集方式为腰椎穿刺,样本一经分离,请务必立即置于冰上或4℃短暂保存(不得超过4h),避免受到血液污染,勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放;
(2)样本室温下3000g离心15min去除细胞及部分碎片,取上清,-80°C保存。
胆汁样本制备方法:
(1)用无菌容器收集胆汁;
(2)将收集到的胆汁在4℃下,3000g离心10min去除细胞沉渣和碎片;
(3)收集胆汁上清液,4℃或者-20℃长期保存。

5 自提外泌体样品

样本类型 送样量/库 样本保存和运输 注意事项
自提外泌体 体积不超过200μl,粒径浓度要在1×109个/ml以上或者BCA测定蛋白量在30-40μg以上。 加入≤200μl RNase-free的PBS并充分混匀或送沉淀。液氮速冻,干冰运输。 自行富集的外泌体可接外泌体鉴定,但可能存在无法鉴定为外泌体的情况。

6 外泌体RNA送样量

样本类型 送样量/库 样本保存和运输 注意事项
smallRNA 送样量>10ng,Aligent 2100检测在25-200nt长度范围有峰。 收集于EP管中,液氮速冻,干冰送样。 若送提取好的RNA,以高灵敏安捷伦2100检测为准。
ncRNA 送样量>5 ng, 2100 检测在 80-200 nt 长度范围有峰,大于 2000 nt 无峰,且 FU>10。
注意事项:
若用qubit定量结果要在150ng以上(原因:nanodrop检测结果偏高);若用分光光度计由于超过检测最低下限因此不具有参考意义,至少要200ng以上。

7 样本测序送样量和鉴定量汇总

样本来源 电镜 粒径 表面标志蛋白检测/指标 测序量
样本来源 TEM NTA 纳米流式 WB 纳米流式 送样量
外泌体 10μl 10μl 10μl 20μl 10μl ≤200μl,≥109个/ml
血清/血浆 1ml 1ml 0.5ml 1ml 0.5ml 4-5ml
细胞上清 5ml 5ml 5ml 10ml 5ml 30ml
尿液 5ml 5ml 5ml 10ml 5ml 30ml
唾液* 0.5ml 0.5ml 0.5ml 1ml 0.5ml 10ml
脑脊液 1.5ml 1.5ml 1.5ml 3ml 1.5ml 20ml
羊水 5ml 5ml 5ml 10ml 5ml 50ml
精液* 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 15ml
胆汁 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 15ml
胸/腹水 2ml 2ml 2ml 4ml 2ml 40ml
乳汁* 2ml 2ml 2ml 4ml 2ml 50ml
卵泡液* 2ml 2ml 2ml 4ml 2ml 50ml
注意事项:
(1)*为非常见样本,送样前请先与技术/产品经理确认。
(2)其他类型或不常见样本请单独咨询产品线;
(3)关于鉴定:因为蛋白检测需要进行单独的蛋白孵育,因此粒径检测的纳米流式和用于蛋白检测的纳米流式并非同时进行。在送样时如果需要用流式做粒径和蛋白检测,需要按照上表各自的量准备。

8 注意事项

(1)细胞上清进行外泌体lncRNA测序项目前,需提前评估;
(2)自提外泌体类型样本,均为风险样本;
(3)细胞培养基必须使用去除exosome(de-exosome)的血清或者无血清培养基(例如ThermoFisher的SFM);
(4)分离外泌体前的样品不能加入任何RNA保护剂(如Trizol/RNAlater);
(5)不建议自行富集外泌体,增大项目风险且不利于排查流转;建议直接送原样本;若自行富集外泌体,建议提取完核酸后送样;
(6)离心管在放入冰箱前,用封口膜密封;储存条件以及储存时间影响外泌体得率,保存在-80℃冰箱中的样本,如果储存时间过长,外泌体产量也会显著降低;
(7) 全血建议使用PAXgene管保存,不可冻融,取血后尽早制备血浆或血清,血浆或血清可以-80°C保存,避免反复冻融;
(8)不接只做鉴定的样本服务。

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