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送样建议

翻译组Ribo-seq

声明:
实验室不接收《人间传染的病原微生物名录》(点击查看)的所有样品。对于高毒性动植物等样品,必须事先通过销售、客服或运营经理与J9九游会技术人员联系,确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
提取风险提示和注意事项:核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系,尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响,因此较难保证单次提取满足质量要求,客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸,请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本,建议自行提取。取样过程中,需要全程佩戴手套,并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒,以免样本污染

1. 常见样本类型

客户分离的RPF(胶回收后的RNA)改为:客户分离的RPF(去除核糖体蛋白后的RNA片段)

2. 细胞类样本(不接未固定的细胞样本)

  • 2.1 贴壁细胞

    样本类型 送样量 保存/运输 备注
    贴壁细胞 5×106,细胞活性90%以上 冻存管分装后液氮速冻;-80℃保存,干冰运输 需放线菌酮固定
    样本制备方法:
    (1)培养贴壁细胞,细胞总量应为至少5×106个。吸出培养基,加入新鲜培养基(含放线菌酮,终浓度0.1mg/ml),孵育1min;
    (2)吸出培养基并将细胞置于冰上。用10ml预冷的PBS(含放线菌酮,终浓度在0.1mg/ml)轻轻冲洗一次,吸干液体;
    (3)再加入1-2ml预冷的PBS(含放线菌酮,终浓度0.1mg/ml),侧拿皿使之一定程度倾斜,用一次性细胞刮刀轻轻刮下细胞,刮的时候顺一个方向转着刮,集于底侧;
    (4)用1ml枪吸净置预冷1.5ml EP管内(一次吸不完可离心弃上清后再吸);
    (5)利用已预冷的4℃离心机收集细胞,500g离心5min,吸弃上清,收集细胞;
    (6)液氮速冻。-80℃暂存,干冰运输。
    放线菌酮为剧毒化合物,操作时注意做好防护,处理后残余物不要随意丢弃。
    若需裂解,请按如下操作:
    (1) 所需试剂
    试剂 储存条件
    细胞培养液 4 ℃
    PBS 4 ℃
    Polysome Buffer 4 ℃
    10% Triton X-100 -20 ℃
    100 mM DTT -20 ℃
    DNase I(1U/μl) -20 ℃
    50 mg/ml cycloheximide -20 ℃
    (2)配置裂解液(每个样本 1ml),4℃预冷。
    试剂 体积(μl) 储存条件
    Polysome Buffer 878 4 ℃
    10% Triton X-100 100 -20 ℃
    100 mM DTT 10 -20 ℃
    DNase I(1U/μl) 10 -20 ℃
    50mg/ml cycloheximide 2 -20 ℃
    (3)贴壁细胞裂解液制备
      1)培养贴壁细胞,细胞总量应为至少5×106个。吸出培养基,加入新鲜培养基(含放线菌酮,终浓度0.1mg/ml),孵育1min。
      2)吸出培养基并将细胞置于冰上,用10ml 预冷的PBS(含放线菌酮,终浓度 0.1mg/ml)冲洗细胞。
      3)吸出并弃掉PBS,加入1ml裂解液至培养皿中使用细胞刮刀或者移液枪轻柔收集细胞,并将其转移至离心管中。
      4)冰上孵育10min,定时颠倒混匀。
      5)4°C,20000g 离心10min,将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
      6)使用裂解缓冲液校零 后,测量裂解产物初浓度,初浓度≥500ng/μl,即可进行干冰送样。
    注意事项:
    (1)需要使用放线菌酮进行固定后冻存送样,若要裂解送样(需要使用裂解液,不接收研磨后的样品),裂解液浓度需≥500ng/μl,每个样本按照300μl/管进行分装,干冰送样。
    (2)同时进行转录组测序的,请根据转录组送样要求另外准备样本。
    (3)J9九游会收到固定后的细胞样本,会用含放线菌酮的裂解液对其进行再次固定,时间为20min。

  • 2.2 悬浮细胞

    样本类型 送样量 保存/运输 备注
    悬浮细胞 5×106,细胞活性90%以上 冻存管分装后液氮速冻;-80℃保存,干冰运输 需放线菌酮固定
    样本制备方法:
    (1)取至少5×106个细胞,500rpm离心5min,弃上清。
    (2)加入新鲜培养基(含放线菌酮,终浓度0.1mg/ml),轻柔吹吸混匀,500rpm离心5min,弃上清。
    (3)加入1ml预冷的PBS(含放线菌酮,终浓度0.1mg/ml),轻柔吹吸混匀,转移至预冷1.5ml EP管内,500rpm离心5min,弃上清。
    (4)500g,4℃,离心5min,吸弃上清,收集细胞;
    (5)液氮速冻。-80℃暂存,干冰运输。
    放线菌酮为剧毒化合物,操作时注意做好防护,处理后残余物不要随意丢弃。
    若需裂解,请按如下操作:
    (1) 所需试剂
    试剂 储存条件
    细胞培养液 4 ℃
    PBS 4 ℃
    Polysome Buffer 4 ℃
    10% Triton X-100 -20 ℃
    100 mM DTT -20 ℃
    DNase I(1U/μl) -20 ℃
    50mg/ml cycloheximide -20 ℃
    (2)配置裂解液(每个样本 1ml),4℃预冷。
    试剂 体积(μl) 储存条件
    Polysome Buffer 878 4 ℃
    10% Triton X-100 100 -20 ℃
    100 mM DTT 10 -20 ℃
    DNase I(1U/μl) 10 -20 ℃
    50mg/ml cycloheximide 2 -20 ℃
    (3)悬浮细胞裂解液制备
    1)取至少5×106个细胞,800rpm离心5min,弃上清。
    2)加入新鲜培养基(含放线菌酮,终浓度 0.1mg/m),轻柔吹吸混匀,800rpm离心5min,弃上清。
    3)加入1ml预冷的 PBS(含放线菌酮,终浓度 0.1mg/ml),轻柔吹吸混匀,800rpm离心5min,弃上清。
    4)加入1ml裂解液,轻柔吹吸混匀;后冰上孵育10min,定时颠倒混匀。
    5)4°C,20000g离心10min,将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
    6)使用裂解缓冲液校零后,测量裂解产物初浓度,初浓度≥500ng/μl,即可进行干冰送样。
    注意事项:
    (1)需要使用放线菌酮进行固定后冻存送样,若要裂解送样(需要使用裂解液,不接收研磨后的样品),裂解液浓度需≥500ng/μl,每个样本按照300μl/管进行分装,干冰送样。
    (2)同时进行转录组测序的,请根据转录组送样要求另外准备样本。
    (3)J9九游会收到固定后的细胞样本,会用含放线菌酮的裂解液对其进行再次固定,时间为20min。

3. 动物组织

样本类型 送样量 保存/运输 备注
动物组织 ≥300mg 冰上分割小块,分管备份;液氮速冻,-80℃保存,干冰运输 选用新鲜采集的样本,优先选择核酸含量高的部位,冰上取样,建议送备份
样本制备方法:
(1)动物组织取材后用预冷的RNase-free水冲洗,去除血渍和污物,并剔除非研究所需的组织,吸干水渍;
(2)冰上操作,将组织切小块(厚度小于0.5cm),放入已标记好的旋盖冻存管中,迅速浸入液氮中速冻至少1h,然后保存于-80℃冰箱,以避免实验操作前样本降解;干冰运输。
(3)为确保实验的顺利,建议样本备份1-2份,每份至少>300mg,以防部分样品降解重新取材,制备或送样。
动物组织裂解(建议送组织,如送裂解产物需按如下流程获得):
(1)所需试剂
试剂 储存条件
Polysome Buffer 4 ℃
10% Triton X-100 -20 ℃
100 mM DTT -20 ℃
DNase I(1U/μl) -20 ℃
50mg/ml cycloheximide -20 ℃
(2)配置裂解液(每个样本 1ml),4℃预冷。
试剂 体积(μl) 储存条件
Polysome Buffer 878 4 ℃
10% Triton X-100 100 -20 ℃
100 mM DTT 10 -20 ℃
DNase I(1U/μl) 10 -20 ℃
50mg/ml cycloheximide 2 -20 ℃
(3)动物组织裂解液制备
1)取0.3g 动物组织,液氮充分研磨至粉末状(一定要研磨充分,利于后期的裂解)。
2)研钵中加入2ml的裂解液,轻柔吹打,用移液枪将裂解液转移至离心管中。
3)冰上孵育10min,并定时颠倒混匀。
4)4°C,20000g离心10min,将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
5)使用裂解缓冲液校零后,测量裂解产物初浓度,初浓度≥500ng/μl,即可进行干冰送样
注:裂解前超纯水快速清洗组织2次。
注意事项:
(1)组织样本裂解前,需使用超纯净水快速冲洗2遍;
(2)组织样本建议直接冻存送样:取新鲜组织,每个样本按照0.3g/管,切块后液氮淬灭,分装,干冰送样;
(3)裂解送样(需要使用裂解液,不接收研磨后的样品),裂解液浓度需≥500ng/μl,每个样本按照300μl/管进行分装,干冰送样。
(4)若为多组织取样,优先取易降解组织(肝/脾/胰脏等),每单个组织取完样,应立刻液氮速冻保存!
(5)同时进行转录组测序的,请根据转录组送样要求另外准备样本。

4. 植物组织

样本类型 送样量 保存/运输 备注
植物组织 ≥300mg 冰上分割小块,分管备份;液氮速冻,-80℃保存,干冰运输 选用新鲜采集的样本,优先选择核酸含量高的幼嫩部位,建议送备份
样本制备方法:
(1)从植物体上取下研究所需的新鲜幼嫩、生长旺盛的组织,用预冷的RNase-free水将材料表面的灰尘或泥土冲洗干净,吸干;
(2)若组织体积较大,应在冰上将其切成小块或者薄片,放入2ml或者更大体积的旋盖冻存管中,标记好样本名称;
(3)迅速浸入液氮中速冻至少1h,保存于-80℃冰箱,以避免实验操作前样本降解;干冰运输。
(4)为确保实验的顺利,建议样本备份1-2份,每份至少>300mg,以防部分样品降解重新取材,制备或送样。
若需裂解,请按如下操作:(建议送组织,如送裂解产物需按如下流程获得)
(1)植物组织 polysome buffer 配方
试剂 储存条件
Tris-Cl pH 7.5 50mM
KCl 0.2mM
MgCl2 15mM
(2)所需试剂
试剂 储存条件
Polysome Buffer 4 ℃
10% Triton X-100 -20 ℃
β-巯基乙醇(20mM) -20 ℃
DNase I(1U/μl) -20 ℃
50mg/ml cycloheximide -20 ℃
(3)配置裂解液(每个样本 1ml),4℃预冷。
试剂 体积(μl) 储存条件
Polysome Buffer 878 4 ℃
10% Triton X-100 100 -20 ℃
100 mM DTT 10 -20 ℃
DNase I(1U/μl) 10 -20 ℃
50mg/ml cycloheximide 2 -20 ℃
(4)植物组织裂解液制备
  1)取0.3g植物组织,液氮充分研磨至粉末状(一定要研磨充分,以利于后期裂解)。
  2)研钵中加入2ml裂解液,轻柔吹打,用移液枪将裂解液转移至离心管中。
  3)冰上孵育10min,定时颠倒混匀。
  4)4°C,20000g 离心10min,将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
  5)使用裂解缓冲液校零后,测量裂解产物初浓度,初浓度≥500ng/μl,即可进行干冰送样。
注:裂解前用超纯水快速漂洗组织2次。
注意事项:
(1)在取样前,请使用超纯净水冲洗,保证无泥土等杂质污染;
(2)植物组织建议直接冻存,分装,用锡箔纸包裹,干冰送样;
(3)裂解送样(需要使用裂解液,不接收研磨后的样品),裂解液浓度需≥ 500ng/μl,每个样本按照300μl/管进行分装,干冰送样;
(4)同时进行转录组测序的,请按照转录组送样要求另外准备样本。

5. 其他样本类型

样本类型 送样量 保存/运输 备注
RPFs ≥200ng/μl,5μl以上 液氮速冻,-80℃保存,干冰运输 过柱法、蔗糖梯度离心收集或其他方式。

6. 注意事项

Ribo-seq同时做转录组建库,请另外按照转录组送样要求进行样本的准备,不可使用同一管样本建库。
细胞与动物组织 polysome buffer 配方
试剂 浓度
Tris-Cl pH 7.5 20mM
NaCl 150mM
MgCl2 5mM
DTT 1mM

7 样本打包及寄送建议

  • 7.1 样本的打包

    (1)核酸样品建议使用质量好的1.5ml或2ml 低吸附EP管装载样品,并用封口膜封口。为了防止样品管破裂,或者污染和混乱,请不要使用诸如PCR管、0.5ml EP管、八联管、96孔板、深孔板等非标准管送样。非标准管不利于样品保存以及后续实验的进行。如有样品使用非标准管制备,还请在送样前自行转管处理。
    (2)组织样本建议根据送样量使用合适规格带螺纹帽的EP管、冻存管或者离心管装载组织样品,并用封口膜封口。
    (3)为防止样品管在运输过程中受到干冰挤压破裂,最好将样品管放到50ml离心管或其他支撑物中,并在支撑物里添加棉花或卫生纸缓冲。大量样品建议将EP管放置在冻存盒中,并在冻存盒外面包裹气泡垫。如使用锡箔纸、自封袋装载的样品,为防止运输中受挤压破损,建议将锡箔纸折叠整齐装在自封袋中,在样品包装外再用气泡垫包好并固定。
    (4)对于血液样品,建议采用5-10ml 塑料抗凝采血管装载,为了防止运输过程中采血管因挤压而损坏,需要将每支采血管管身均用气泡垫包好,然后放置到塑料或纸质包装盒中。
    (5)用乙醇沉淀的样品由于运输中会有少量乙醇挥发出,建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈。
    (6)为便于处理和保存,组织样品送样量请不要超过建议送样量的5倍(特殊的得率较低的样品除外)。
  • 7.2 样本的名称标识

    (1)所有的样品必须具有清晰的标记,并且简洁明了。
    (2)使用锡箔纸包装的组织样品建议在锡箔纸内外均标记样品名称,并将锡箔纸放在自封袋中,自封袋外面再标记上样品名称,防止锡箔纸上样品名称模糊引起样品混乱。
    (3)使用乙醇沉淀的核酸样品,由于挥发出的乙醇会使记号笔的标记模糊,建议用油性记号笔将样品名称写在标签纸上,然后用透明胶带将标签纸粘贴在样品管壁上,并缠绕2-3圈。
    (4)样品名称建议使用“字母+数字”命名方式标注在管盖。其他信息如日期、浓度、物种等可标注在管壁。所有标注内容需与《样品信息单》保持一致。

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