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表观组测序

案例一 一种快速化学重编程系统通过类滞育状态促进细胞命运转换

期刊以及IF:Nature Cell Biology;21.3
合作单位:浙江大学生命科学研究院祝赛勇教授团队
研究材料:小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠背侧成纤维细胞(MDF)、小鼠肺成纤维细胞(MLF)以及iPSC细胞
测序产品:CUT&Tag、ATAC-seq、RRBS、scRNA-seq、RNA-seq
结论:通过大规模的化学分子筛选,建立了快速化学重编程系统(FCR),其快速的动力学和高效率大大加快了细胞重编程的过程,为细胞重编程全面特征和分子机制提供了独特见解。

一、研究思路

二、研究结论

  • 2.1 确定关键分子,构建高效快速的FCR系统

    研究人员利用大规模的化学筛选方法确定了一系列有效分子,通过调整有效小分子的浓度和处理时间,建立了快速化学重编程(FCR)系统。其中,关键多能性基因Oct4在重编程第7天就已经被激活,进一步说明了FCR的快速性。通过细胞、分子和功能实验证明经过12天FCR产生的iPSC细胞在形态、分子和功能上与小鼠胚胎干细胞相似,表明FCR平台成功重编程。
  • 2.2 ATAC-seq预测胚外内胚层相关的TFs

    间充质向上皮转化(MET)和胚外内胚层(XEN)状态已被证明是CR过程中的关键状态。研究人员发现FCR与转录因子重编程(TFR)都会经历这两种状态,但在重编程路径上有明显差别,ATAC-seq组学预测胚外内胚层相关的TFs(Sox17、Gata4、Gata6和Foxa2)导致了两个重编程体系的路径差异。
  • 2.3 RNA-seq显示FCR会经历一个独特的滞育类状态

    选取了8个关键时间点的样本:0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、产生的iPSC cell。研究人员对比不同时间点不同重编程系统的转录组数据发现:FCR后期显著下调了核糖体、剪切体、DNA复制相关基因,但在TFR过程中并无此现象。这一结果揭示了FCR重编程后期会经历一个独特的滞育类状态。
  • 2.4 滞育类状态是FCR过程中一个重要的中间态

    考虑到细胞异质性,研究人员选取5个时间点样本:0天、4天、8天、12天、iPSC cell进行scRNA-seq分析,FCR依次会经历成纤维细胞、上皮样细胞、中间态细胞、新生iPSC和iPSC阶段,且scRNA-seq功能通路数据与RNA-seq结果一致,滞育相关基因在FCR后期细胞呈现明显下调。敲低促进细胞进入滞育状态的关键基因Larp1、Slc17a5、Prkaa1发现抑制滞育类状态会导致FCR效率降低,说明滞育类状态是FCR过程中一个重要的中间态。
  • 2.5 ATAC+CUT&Tag证明H3K9me3通过抑制iPSC相关的ERVs影响FCR进程

    选取了8个关键时间点的样本:0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、产生的iPSC cell,通过ATAC-seq & CUT&Tag多组学分析显示:染色质可及性区域大部分在FCR过程中呈现高度动态,即使在FCR后期的滞育类状态,且伴随着不同组蛋白修饰的动态变化。 H3K9me3作为异染色质区域的标志性沉默修饰,此前多次被证实在干细胞中可以调控ERVs。而在FCR过程中,ERVs的表达模式也呈现从MEF向iPSC的动态变化,说明了ERVs可能也会参与并影响重编程过程。该研究筛选了24个受H3K9me3调控的iPSC相关的ERVs(经典Oct4-Sox2-Tcf-Nanog TF基序)。敲低和小分子抑制实验证明H3K9me3甲基转移酶的抑制可以促进FCR进程;而敲低iPSC相关ERVs相关靶蛋白会导致FCR效率降低。这些结果说明H3K9me3通过抑制iPSC相关的ERVs从而作为FCR的障碍。

案例二 CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells

期刊:Nature Communications
发表年份:2019年4月

一、研究背景

研究对比了CUT&Tag、CUT&RUN和ChIP-seq 三种方法检测DNA和蛋白互作位点的鉴定效果,包括H3K4甲基 化在内的多种组蛋白修饰、RNA Pol II检测、转录因子结合靶点鉴定。

二、研究结果

  • 1.相同测序深度下CUT&Tag具有更低的背景噪声水平,而ChIP-seq需要更大的测序深度才能将染色质特征与背景区分开。
  • 2.检测不同测序深度下峰的富集效率图,发现CUT&Tag可以更快地填充低测序深度的峰,表明在相同测序深度下,CUT&Tag检测的信号值更高,灵敏度更好。
  • 3.分别对三种方法做了两次重复实验,并对实验结果进行分层聚类相关矩阵分析,证明了在本次实验中CUT&Tag实验数据结果可重复性最好。

参考文献

[1] Chen X, Lu Y, Wang L, et al. A fast chemical reprogramming system promotes cell identity transition through a diapause-like state[J]. Nature Cell Biology, 2023, 25(8): 1146–1156.

[2] Hatice S, Kaya-Okur, Steven J, et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): p. 1930.

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