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送样建议

DSP 空间转录组\蛋白质测序

声明:
实验室不接收《人间传染的病原微生物名录》(点击查看)的所有样品。对于高毒性动植物等样品,必须事先通过销售、客服或运营经理与J9九游会技术人员联系,确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
提取风险提示和注意事项:核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系,尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响,因此较难保证单次提取满足质量要求,客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸,请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本,建议自行提取。取样过程中,需要全程佩戴手套,并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒,以免样本污染

1.样本类型

样本类型 送样量/样 保存条件 运输条件
OCT包埋冰冻组织块 1块 密封后,-80℃保存
包埋盒外标注切割面
干冰运输
FFPE 组织块 1块 密封后,4℃保存 冰袋运输
冰冻切片 ≥ 5张切片(邻片),切片厚度~5 μm 使用防脱片载玻片贴片;
密封后,-80℃保存
干冰运输
FFPE 切片 ≥ 5张切片(邻片),切片厚度4~6 μm 新切切片,使用防脱片载玻片贴片;
干燥密封,4℃保存时间<14天
冰袋运输
荧光抗体(直标) 1管(可选择的荧光通道:AF532, AF594, AF647) -80℃保存 干冰运输
Notice:
1.OCT包埋时将所关注的切面平行于包埋盒底部进行包埋,关注的切面朝下放置, 我司实验室收到样品后按照平行于包埋盒底部的角度进行切片,如有特殊情况需 提前告知;
2.如寄送非直标抗体,请联系后台产品经理进行评估。

2.送样地址

收件人:J9九游会样品组
电话:18526699037
邮寄地址:天津市武清开发区创业总部基地B07

3.OCT包埋冰冻组织块送样要求

  • 3.1 冰冻样本送样要求

    密封后,-80℃保存。在OCT包埋盒外注明切割面,干冰运输(OCT包埋块没有年限要求,以质检结果RIN值为准);
    建议组织截面积<35.3mm×14.1mm。
  • 3.2 OCT包埋方法及注意事项

    3.2.1所需试剂及耗材
    名称 厂商 货号 备注
    OCT 组织包埋剂 日本樱花SAKURA PN-4583 湿冰或4℃冰箱预冷≥30min
    组织包埋盒 / / 包埋盒大小:17*17*5mm
    干冰 / / 将干冰尽量敲碎
    医用镊子 / / 使用前干冰预冷≥30min
    锋利刀片 / / 使用前干冰预冷≥30min
    实验用吸水纸 / /
    Notice:所需试剂耗材,均由客户自行准备
    3.2.2准备工作
    (1)将干冰盒中的干冰尽量敲碎,将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
    (2)将OCT包埋剂放入湿冰中预冷,预冷30min以上,(或可放入4℃冰箱中预冷)。
    (3)准备好冷冻组织包埋盒,记号笔标注好样品信息及方向。
    Tips:使用太小的组织包埋盒,容易使包覆样本的OCT包埋剂过少,可能造成组织裸露,从而影响组织RNA质量。
    图1 试剂耗材预冷、包埋盒标记 3.2.3取样
    (1)尽量收集新鲜组织样本,避免室温长时间放置,避免污染;临床样本建议将组织放在干净的离心管或密封袋中,埋入湿冰中短暂保存和运输(小于30 min)。
    (2)使用实验用吸水纸吸干组织表面血渍或水渍,尽量避免使用PBS或组织清洗液润洗组织,新鲜组织如样本过大,建议在速冻前先将组织分割成多个小块,样本过大可能会导致组织冷冻不均匀。
    Tips① 如组织样本表面较软,不易修剪,可提前将锡箔纸铺到干冰上,将组织放到锡箔纸上进行预冷,表面稍许变硬后再进行修剪;
    Tips② 如样本较薄,可同时制备包埋多份样本,以保证样本足够用于质检、透化和正式实验;
    Tips③ 如样本较厚,需准备高度适宜的包埋盒或将一个包埋盒底部去除,再将另一个包埋盒与其进行叠放,以增加样品包埋高度;
    图2 吸水纸组织表面清理、包埋盒底部去除 3.2.4包埋
    (1)将组织包埋盒放到干冰盒内,向包埋模具内注入少量经过湿冰预冷的OCT,注意不要产生气泡。
    (2)将上述修剪好的组织块或冰冻组织找好角度,水平放置在组织包埋盒中。
    (3)继续注入OCT包埋液直至整个组织块被完全包埋。
    Tips:自中心点沿时针方向连续轻柔挤出,可有效避免气泡的产生,如产生气泡,可用镊子或细枪头将气泡挑破或向外侧挤出。
    Notice:将所关注的切面平行于包埋盒底部进行包埋,关注的切面朝下放置,我司实验室收到样品后按照平行于包埋盒底部的角度进行切片,如有特殊情况需提前告知。
    3.2.5速冻
    组织包埋盒继续放置在干冰上并盖上干冰盒盖子,速冻10min-20min直至包埋剂变硬变白。
    图3 OCT包埋冷冻 3.2.6保存
    包埋后的组织固定在包埋盒中,转入自封袋内标记好送样信息即可干冰寄送样本。如暂不送样,则需要将包埋块密封好后放在-80℃冰箱中冻存。
    Notice:必须密封储存样本,否则可能会导致组织脱水和损伤。
  • 3.3 新鲜组织冻存操作方法

    3.3.1 所需试剂及耗材
    名称 厂商 货号 备注
    异戊烷 Sigma 270342
    液氮 / /
    干冰 / / 将干冰尽量敲碎
    液氮及异戊烷容器 / / /
    医用镊子 / / 使用前干冰预冷≥30min
    锋利刀片 / / 使用前干冰预冷≥30min
    实验用吸水纸 / /
    Notice:所需试剂耗材,均由客户自行准备
    3.3.2准备工作
    (1)干冰盒中的干冰尽量敲碎,将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
    (2)将OCT包埋剂放入湿冰中预冷,预冷30min以上,(或可放入4℃冰箱中预冷)。
    (3)准备金属容器,在金属容器中倒入2/3体积的异戊烷,再将金属器皿放在液氮中,制备成异戊烷液氮浴装置,异戊烷在液氮中预冷10-15min。
    Tips① 异戊烷液氮浴装置中,液氮和异戊烷处于同一水平线;
    Tips② 异戊烷预冷时间长会出现结冰情况,如未满15min即出现结冰现象,则可以缩短预冷时间,当异戊烷结冰时,可将异戊烷从液氮中取出室温放置一小段时间。
    图4 异戊烷液氮浴装置 3.3.3取样
    取样过程同“3.2.3取样”
    3.3.4冷冻
    (1)用镊子将组织放入异戊烷,完全浸入液面1min至完全冷冻,冷冻时间根据组织类型和大小而有所不同。
    (2)冷冻后,迅速将组织转移到提前预冷的低温冷冻管中,并放置在干冰上。
    Notice:请不要直接使用液氮对组织进行速冻,组织表面与液氮的巨大温差会导致液氮在组织表面沸腾,可能会导致气泡空腔或不均匀冷冻,最终影响组织形态。
    图5 低温冻存管保存组织 3.3.5保存
    将放入冷冻管内的冷冻组织密封好放入样本存放盒或密封袋中,标记好样本信息,放在-80℃长期保存。开展实验前,可将冷冻样本取出后按照“3.2.3取样”的流程完成样本包埋工作。

4.FFPE蜡块送样要求

  • 4.1 FFPE样本送样要求

    石蜡包埋块密封后4℃保存,冰袋寄送(蜡块没有年限要求,以质检结果DV200为准);
    建议组织截面积<35.3mm×14.1mm。
  • 4.2 石蜡组织包埋方法及注意事项

    4.2.1样本预固定处理
    (1)样本来源分类:
    A切除标本(手术活检),在手术时切除整个器官或受累部位——大样本剖开但不切断方式进行充分固定;
    B切口活检标本,从受累部位内取下组织——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中;
    C钻孔活检,通过钻孔取出一小块可疑组织(通常来自皮肤)——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中;
    D刮拭活检,从表面(通常是皮肤)上“刮取”较小的组织碎片——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中;
    E刮宫,从子宫或宫颈的黏膜上刮取小片组织——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中;
    F空芯针穿刺活检,有时使用一根特殊的针穿过皮肤(经皮)取出少量组织样本——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中;
    B-F类的组织若过于细小,可以用两片浸湿的滤纸,将其夹在中间;
    本步骤中强调:
    (1)仔细检查样本信息和随附文件一一对应,所有详细信息均有记录,并可以做到“标本追踪”。
    (2)切除后的新鲜组织,为了防止变性或干燥,应尽快固定(样本离体30min内尽快放入10-15倍体积中性缓冲福尔马林固定液中)。标本好越早开始固定,结果越好,并在样本袋外标签处填写详细样本编号等识别信息。
    (3)在处理标本之前,应将体积大的样本浸入福尔马林20小时进行固定。
    4.2.2样本目的部位取材
    (1)涉及对标本进行仔细检查和描述,包括外观、标本块数量及其尺寸。
    A取出预处理的样本,较大的标本需要进一步切开,从目的部位切下2~4mm厚的切片代表性组织块。
    B取出预处理的样本,对于较小的标本,可以处理整个标本,将其直接放在包埋盒(小孔篮)中。
    图6 石蜡预处理样本 4.2.3样本脱水浸蜡
    处理大批量标本时,一般使用“组织处理机”的自动化仪器。这些仪器可以在熔化石蜡加工的一系列不同的溶剂中浸润标本,标本一开始处于水环境中(水基),且必须通过溶剂(通常为乙醇和二甲苯)脱水和清除的多次变化后才能放入熔化的蜡(疏水且不混溶于水)中。对特定批次标本选择的“处理时间表”的持续时间和步骤详细信息取决于标本的性质和大小。对于较小的标本,时间表可短至几个小时,对于较大的标本,时间表可长达12小时或更长;
    4.2.4样本石蜡包埋
    将标本从包埋盒中取出并放入蜡填充的模具中。在这个阶段,应仔细定向标本,因为这将决定切割切片的平面,一般以模具底面为目的截面,也就是最终在显微镜下观察的组织截面。
    在组织已处理的包埋盒中带有标本识别详细信息,现在将包埋盒放在模具顶部,并添加更多蜡来将其黏附固定。现在,标本“块”可在一个冷表面上固化,固定后即可移除模具。包埋盒现在充满了蜡并形成了“块”的一部分,此步骤也为了夹入切片机提供了稳定的底座,将其牢固夹在切片机的标本架中,从块表面切下切片(如图所示)。
    图7 A为模具中的样本固定,B为夹在标本架中的样本 4.2.5注意事项
    (1)组织离体时间:组织块离体后应尽快固定,缺血离体时间不宜超过1h。
    (2)组织固定液:推荐10%NBF或4%PFA,10%NBF穿透力强,4%PFA穿透力弱一些。
    (3)固定时间:根据组织块大小决定,0.5cm直径组织块一般固定18-24h,时间不宜过长。
    (4)存放条件:蜡块存放环境需保持干燥,可放入干燥器,室温保存。干燥器如下图所示:
    图8 干燥器

5.冰冻切片/ FFPE切片送样要求

  • 5.1 冰冻切片

    切片厚度~5μm;
    贴片后,放入载玻片盒,再装入密封袋密封,-80℃保存,干冰运输。
  • 5.2 FFPE切片

    切片厚度4~6μm;
    根据样本大小,每个样本首先需要切5-10张蜡卷,单独放入离心管中,冰袋寄送至公司进行质检(DV200);
    样本质检合格后,再使用粘附性载玻片贴片,干燥后放入载玻片盒,再装入密封袋密封,冰袋运输。
  • 5.3 送样量

    寄送 ≥ 5张贴片(样本为邻片),建议贴片面积<35.3mm×14.1mm。
    ※寄送的5张贴片,3张由J9九游会进行免疫荧光成像质控,1张由J9九游会进行DSP正式建库测序,1张用于备份。
    Notice:为了避免RNA降解带来的影响,切片需要尽量在14d以内完成DSP正式建库,建议老师切片后尽快寄送。
  • 5.4 注意事项

    (1)切片选择:
      包埋块修片前几张切片不用于试验,挑选远离包埋块表面的切片。
    (2)贴片要求:
      1)使用具有粘附性或带正电荷的防脱载玻片进行贴片,组织需位于载玻片中央(下图绿色矩形区域,最大面积为35.3 mm × 14.1 mm),超出绿色矩形的组织区域将不能被建库测序;   注:防脱载玻片没有品牌限定,可使用常见的世泰牌粘附载玻片(货号:188105W)。部分疑难样本(骨,脂肪,皮肤等)使用粘附性载玻片仍有较高的脱片风险,需要根据实际情况判定。
    图9:浅蓝色边框为载玻片大小;深蓝色六边形为仪器固定区域;绿色矩形为贴片区域和仪器捕获范围   2)切片、贴片时避免产生划痕和褶皱,谨防后续试验中样本信息获取不完整或脱片;
      3)贴好FFPE样本的载玻片需在加热托盘或烘箱进行烤片;烤片后的玻片室温干燥储存、可放置于干燥器内。或载玻片置于载玻片盒,装入密封袋保存(密封袋中可放干燥剂)。
      4)建议使用新切切片进行贴片。

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