发文单位：中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）王洪、程涛、朱平、周家喜课题组，联合西湖大学郭天南、南开大学沈中阳及天津大学王西墨发表期刊：Immunity（IF=32.4）发表时间：2023年5月16日研究结果：该研究通过对转录组、蛋白质组、代谢组和免疫组库等系统性解析，揭示了奥密克戎（Omicron）感染者的血液生态系统，其中本研究中非靶向代谢组学，单细胞转录组及单细胞免疫组等检测服务由J9九游会提供。

背景介绍

新冠大流行是人类历史上最为严重的大流行病之一。截至2022年10月，已有6亿多人感染新冠病毒，累计死亡人数超600万。作为迄今为止最普遍关注的变异株，Omicron与祖先的SARS-CoV-2毒株相比，毒性有所降低，但其传播性却大大增强。因此，Omicron对于免疫缺陷或需要免疫抑制治疗的潜在疾病人群而言仍然是一种危及生命的感染。然而，此前与Omicron相关的不同疾病阶段和严重程度的分子及细胞变化动态尚未完全阐明。

“复阳”背后潜在的分子机制及其对Omicron传播性增强的潜在影响很大程度上仍未可知，目前也没有有效的策略来预测患者的复阳风险。因此，应用血液生态系统理念剖析Omicron病毒感染，对其诊疗与防控具有重要意义。

实验设计

主要结论

01血浆蛋白质组和代谢组分析

作者对Omicron患者和健康对照者进行了血浆蛋白质组学和代谢组学分析，定量了803个蛋白和546个代谢物。蛋白质组学和代谢组学数据分析显示，轻度和中度患者的差异不显著（图1）。然而，健康组、急性感染组和康复组的差异显著，比较发现有476个差异蛋白（DEP）和447个差异代谢物（DEM）。Omicron疾病的不同阶段检测到血小板相关反应，DEM和DEP的联合分析确定了与血小板活化等途径的显著关联。总体研究表明血小板在Omicron感染者中发挥着关键作用。

图1 血浆蛋白质组和代谢组分析揭示Omicron患者明显的血小板相关失调

02多组学整合揭示了宿主反应动力学的全景

为了剖析Omicron突破性感染中血小板功能的分子机制，作者从新冠肺炎患者和健康对照中分离血小板，进行平行蛋白质组和RNA-seq的转录组分析（图2），定量了4804个血小板蛋白，其中簇4蛋白（如：IFIT1、IFIT5和PARP14）在恢复正常水平之前迅速增加，显示出抗病毒免疫的特征，表明了血小板可能在宿主对Omicron突破性感染的快速反应中发挥强大的免疫支持作用。分析结果表明，血小板在急性Omicron突破性感染期间可能具有抗病毒能力。

对健康对照组、感染原始菌株和Omicron菌株患者的转录组测序分析（图2）。Omicron与SARS-CoV-2 感染患者相比，其止血、血小板活化和伤口愈合为特征的血小板促凝特征相关的基因表达较低。结果揭示了原始COVID-19患者的血小板促血栓形成特征更强，进而造成严重的微血栓形成和多器官衰竭，而Omicron患者的血小板表现出更强的抗病毒免疫特征，表明血小板可能参与了感染急性期的免疫反应。

图2 血小板蛋白质组和转录组分析显示Omicron菌株感染下免疫特征增强，血栓形成减少

研究者通过MOFA整合了来自102个标本的4组数据集，并进一步解剖其临床相关性以获得生物学观点（图3）。Omicron菌株感染期与前15个因素的相关性最大，证实了疾病期是血液生态系统变异的主要原因。基于不同Omicron样本的因子值，可将Omicron感染阶段的广泛分子变化分为三组：分别为急性反应（AR）、持续反应（PR）和恢复期反应（CR）。通过对最高加权转录本、蛋白质、代谢物的通路分析，进一步探讨了不同组学数据集中三组疾病期相关因子的生物学功能。Omicron菌株感染会产生两波宿主反应：首先是感染早期血小板参与了宿主对应激反应的准备，包括适应性免疫信号的快速激活以及血小板中干扰素增强刺激的抗病毒信号；其次是恢复期宿主血液生态系统中存在的持久应激，在恢复期细胞对应激和缺氧的反应和活性氧的解毒作用明显；这为快速抑制病毒复制、减少对各种器官的系统损伤，并为全球范围内减弱病毒毒性机制提供了见解。

图3 多组学整合揭示了宿主反应动力学的全景

03单细胞转录组揭示在Omicron突破性感染期间，血小板优先与白细胞形成聚集体以调节免疫细胞功能

为了剖析Omicron感染不同严重程度和阶段之间的免疫失调，对急性、急性后和1个月随访阶段的患者以及健康对照的PBMC样本，通过10× Genomics平台进行单细胞转录组、单细胞BCR和TCR测序（图4A）。得到318,359个NK/T细胞，44,997个B细胞，89,456个单核细胞，10,125个血小板以及7,425个中性粒细胞。通过亚群细分，共获得12个NK/T 细胞亚群，9个B 细胞亚群，8个单核细胞亚群，6个中性粒细胞亚群，以及7个血小板亚群(图4B)。

与健康供体相比，血小板-白细胞聚集体的数量在急性期增加(图4C-G)，与COVID-19病理生理学中描述的血小板活化一致。血小板和各种免疫细胞之间形成的聚集体表明，血小板可能以血小板-白细胞聚集体的形式调节针对Omicron的免疫反应，体外测量血小板和免疫细胞之间的相互作用可证实该结果，同时将白细胞（T细胞作为代表）与从健康供体Omicron 样本中分离的血小板共培养实验表明（图4H-J）：不同疾病阶段的Omicron 患者的血小板非但没有增强免疫特性，而是抑制了T细胞活化，即血小板通过聚集体形成来调节T细胞功能。揭示血小板优先与白细胞形成聚集体，以调节免疫细胞功能，这表明在Omicron突破性感染期间存在非常规的免疫图谱。

图4 Omicron患者外周血细胞的单细胞转录组分析

04单细胞分辨率下揭示Omicron变体的免疫反应

通过健康供体、轻度和中度患者之间免疫细胞亚群的差异基因分析，表明健康供体和患者之间的差异形成鲜明对比，而轻度和中度患者对Omicron变异株的反应相当（图5A）；根据已知的COVID-19现象，中性粒细胞、单核细胞和血小板在 Omicron 患者中表现出高细胞因子、炎症和干扰素基因特征表达。

轻度患者的中性粒细胞中，细胞因子和干扰素表达水平增强，但在中度患者中较低，证实了中性粒细胞反应在轻度患者中的独特敏感性（图5D）。在Omicron急性期，CD16单核细胞显示出细胞因子/干扰素特征的高表达（图5B）。血小板-单核细胞的细胞因子、炎症和干扰素特征表达在急性期升高，随后在急性期后和随访期降低。（图5C）；效应CD8 T细胞和NK细胞在急性感染患者中表现出更高的细胞毒性特征，在急性后和随访阶段逐渐减少（图5E)。揭示了不同免疫细胞在Omicron感染不同时期的免疫应答。

接下来，作者通过单细胞免疫组库（scTCR-seq & scBCR-seq）来进一步剖析Omicron患者免疫库的变化。与健康供体相比，急性期患者的BCR重链和TCR β链的互补决定区3（CDR3）长度增加（图5F），这种增加可能引起抗体的多反应性和自身免疫性。在急性期不同亚型的B细胞和T细胞中检测到的BCR和TCR百分比高于急性期（图5G）。因此，作者进一步分析了不同疾病状态的克隆扩增。在急性期扩增的克隆随后在急性期后减少，但在随访阶段重新出现，尤其是在中度症状患者中（图H）。为了验证这一点，通过香农熵评估了BCR和TCR的多样性，结果表明急性期记忆B和T细胞的BCR和TCR多样性减少在急性期后恢复，但在中度患者的随访阶段再次减少（图5I-J）。最后，BCRs的VDJ基因重排表明，轻度患者B细胞优先表达IGHV2-5、4-30-4和7-4-1。相比之下，中度患者在随访阶段表现出IGHV4-4、1-8、1-2和3-66的偏倚使用（图5K），这些发现为Omicron疫苗的优化设计提供了初步线索。

图5 单细胞分辨率下揭示Omicron 变体的免疫反应

05复阳性患者表现出BCR克隆减少、抗体水平降低和Omicron中和能力降低

由于Omicron患者中存在高比例的复阳性，作者试图从细胞组成、生物过程和免疫库的角度来解释这种现象的机制。通过分析复阳性患者（RP）和非复阳性患者（NRP）间细胞比例变化，发现复阳性患者中效应记忆CD8 T细胞和XCL1 NK 细胞减少，Naive B 细胞增加（图6A），CD16 单核细胞、血小板-单核细胞和中性粒细胞炎症特征增强（图6B-D），CD8效应T细胞，细胞毒性特征减少，耗竭信号增加（图6E-F）。通过分析复阳性患者的单细胞克隆型，结果发现BCR克隆减少，多样性略有增加（图6H）；通过测量血清抗体的水平和中和能力，发现复阳性患者中，病毒特异性抗体产生受损以及抗体中和能力降低（图6I-J），这意味着抗体或血浆疗法可用于预防和治疗复阳性。最后，作进一步开发了一种机器学习模型，可以准确预测Omicron患者的复阳性率。

图6 复阳性患者表现出BCR克隆减少、抗体水平降低和Omicron中和能力降低

结论

作者分析了SARS-CoV-2 Omicron患者的1000多例血浆和血小板样本的临床现象、转录组、蛋白质组、代谢组和免疫系统，并整合多组学分析了多个疾病阶段的宿主反应动力学，以揭示血液中的分子和细胞景观。在Omicron患者中检测到干扰素介导的血小板抗病毒特征增强，血小板优先与白细胞形成广泛的聚集体，以调节免疫细胞功能。此外，复阳性的患者显示出B细胞受体克隆、抗体生成和对抗Omicron的中和能力显著降低等特征。最后，作者开发了一个机器学习模型，预测患者复阳性的可能性，开启了血液生态系统在各种系统性疾病的研究的大门。