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单细胞转录组鉴定了炎症性关节炎的潜在治疗新靶点

2024年9月29日    编辑:J9九游会

发文单位:中国医学科学院/北京协和医学院张烜及杨华夏组

发文期刊:Nature communications

影响因子:16.6

发文日期:2024年3月7日

研究结果:本研究使用单细胞转录组测序对PD-1诱导的IA (PD-1-IA)、RA患者和健康个体的外周血、滑液(SF)中的CD45+细胞进行了分析,确定了与PD-1-IA相关的疾病特异性细胞群。发现IL1Bhi巨噬细胞和CD8+ Texs可能在PD-1-IA的发病机制中起着关键作用,为这种疾病提供了见解。其中本研究中单细胞转录组测序服务由J9九游会提供。

 

背景介绍

炎程序性细胞死亡1(PD-1)抑制剂彻底改变了癌症的治疗。通过释放该免疫检查点建立的制动器,PD-1抑制剂激活抗肿瘤免疫,从而在越来越多的癌症类型的临床试验中取得了巨大的成功。然而,PD-1抑制剂对免疫系统的过度激活有时会对宿主组织造成损害,导致一系列免疫相关不良事件(irAE)。在irAE中,风湿性irAE在临床实践中越来越得到认可。最常见的风湿性irAE似乎是关节痛,发生于11.4 ~ 13.6%的接受免疫检查点抑制剂(ICI)联合治疗的患者。具体而言,发现大约一半的患者在ICI停止后持续存在炎症性关节炎(IA),中位随访时间为9个月。因此,迫切需要阐明PD-1-IA的发病机制,从而在不影响抗肿瘤疗效的前提下指导治疗方案。

 

主要结果

1.PD-1-IA患者、RA患者和HC患者的SFMCs和/或PBMCs的免疫景观

作者对全面表征活动性PD-1-IA 患者(IA_act,n = 5)和活动性血清阳性RA(n = 8)患者的滑液、外周血进行CD45+免疫细胞分选,分选后的细胞用于scRNA-seq。此外,从缓解期 PD-1-IA 患者(IA_rem患者,n = 5)和健康对照 (HCs,n = 8)的配对外周血中获得CD45+免疫细胞(图1a)。为了研究炎症关节的免疫细胞谱,在IA-act患者(n=3)和血清阳性RA患者(n=3)中进行了CD45+SFMC的scRNA-seq(图1a)。通过细胞定义,定义了9个主要细胞群(图1b)。IA_act和RA患者的SFMCs存在显著差异。与RA相比,IA_act中T细胞的比例显著增加,巨噬细胞、cDCs和S100B DCs的比例显著降低(图1c-d)。同样,对PBMCs进行细胞定义,共9种主要细胞类型(图1d)。除血小板外,其他类型细胞占比在四组中没有显著差异(图1e)。这些结果表明IA_act与滑液中T细胞和髓样细胞的主要变化有关,但与外周血中的变化无关。

1 炎症性关节炎和类风湿性关节炎中CD45+细胞的免疫景观

2.  PD-1-IA滑液和外周血中IL1Bhi髓样细胞扩增

SFMCs样本中髓系细胞群进行亚群定义,共定义到9个细胞亚群(图2a)。IA_act组的IL1Bhi巨噬细胞占比高,而RA组几乎没有这种巨噬细胞(图2a-e)。相反,RA组显著富含单核细胞样巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞(图2c)。对PBMCs样本中髓系细胞群进行亚群定义,共定义到8个细胞亚群(图2f),观察到两个IL1Bhi亚簇(IL1Bhi CD14+单核细胞和IL1B+ CD16+单核细胞),几乎只存在于IA_act和IA_rem组(图2g-h)。与IA_act组相比,IA_rem组的IL1B表达显著降低(图2i)。IA_act组的IL1β+ CD14+单核细胞比例显著高于RA组、ICI-nonAE组和HC组(图2j-k)。

2 IL1Bhi巨噬细胞/单核细胞可作为IA相关髓系细胞鉴定物

3. SFMCs中的IL1Bhi巨噬细胞与PBMC中的IL1Bhi单核细胞具有相似的炎症特征,并可能与PBMC相鉴别

SFMCs中的IL1Bhi巨噬细胞,与其他亚群相比,前10个差异高表达基因DEG是趋化因子(CXCL10、CCL3L1、CCL8)、干扰素诱导基因(IFIT2、IRF1GBP1、GBP5)和与M1巨噬细胞表型相关的基因(APOBEC3A12、TNFSF1013、CALHM614)(图3a)。多种炎症途径在IL1Bhi巨噬细胞中显著上调,均被称为PD-1-IA相关炎症信号通路(图3B)。与其他簇相比,IA_act患者的SFMCs中的IL1Bhi巨噬细胞显著上调了所有IA相关的炎症通路,这表明了IL1Bhi簇的促炎致病作用。

PBMCs中IL1Bhi单核细胞的最显著DEGs是趋化因子(CXCL8、CCL3L1、IL1B、CCL4)(图3d)。GSEA分析表明,与IA相关的炎症通路在IL1Bhi单核细胞中也显著上调,其中,IL1Bhi CD14+单核细胞表现出最显著的TNF信号通路上调(图3e-f)。对SFMCs和PBMCs的单核细胞和巨噬细胞进行Monocle3轨迹分析(图3g-h),IL1Bhi单核细胞和巨噬细胞形成了与其他簇不同的轨迹,表明了紧密的细胞过渡顺序紧密(图3i)。IL1Bhi细胞轨迹反映了外周血单核细胞到滑液促炎巨噬细胞的转变,其表型与M1巨噬细胞相似(图3j)。因此,作者认为SFMCs中的IL1Bhi巨噬细胞标记有炎症信号,并可能与PBMCs中的IL1Bhi单核细胞相区别。

3 SFMCs中的IL1Bhi巨噬细胞标记有炎症信号,并可能与PBMCs中的IL1Bhi单核细胞相区别

4. PBMCs或SFMCs的IL1Bhi髓系细胞中,NLRP3炎症小体途径活性升高

IL1β 通常在NLRP3炎症小体激活后产生。在SFMCs中,IL1B三种信号的活性在IL1Bhi巨噬细胞中大多升高,与RA组相比,在IA_act组中显著富集(图4a-b)。NLRP3基因和IL1B基因的共表达,以及NLRP3炎症小体核心通路组分和IL1B基因的共表达,在单细胞转录组中具有显著性(图4c)。

同样,在PBMCs中,NLRP3炎性小体信号的活性在IL1Bhi单核细胞中升高,并且与RA组和HC组相比,IA组显著富集(图4d-e)。与IA_rem组相比,IA_act组中NLRP3炎症小体信号的活性升高(图4d)。NLRP3基因和IL1B基因的共表达,以及NLRP3炎症小体核心通路组分和IL1B基因的共表达,在单细胞转录组中具有显著性(图4f)。总之,这些结果表明NLRP3炎症小体通路在IL1B中的重要作用,IL1Bhi髓系细胞有作为PD-1-IA治疗靶点的潜力。

4活化的NLRP3炎症小体信号是IL1Bhi髓系细胞的特征,治疗后下调

5.PD-1-IA患者SFMCs中CD8+ Tex数量增加

接下来,作者细致研究了滑膜T细胞和NK细胞。在12个明确的T/NK亚群中,5个是CD4+ T细胞亚群(CD4+中枢记忆T细胞[Tcms]、SELL+ CD4+ Tcms、CD4+效应记忆T细胞[Tems]、CD4+ Texs和CD4+调节T细胞[Tregs]),5个是CD8+ T细胞亚群(CD8+粘膜相关不变T细胞[MAITs]、CD8+ Tems、CD8+细胞毒性T细胞[CTLs]、CD8+ Texs和循环CD8+ T细胞);与RA组相比,IA_act组表现出更高比例的CD8+ Texs、CD8+ Tems和CD4+ Tregs细胞,更低比例的 CD4+ Tems和CD4+ Texs细胞(图5c)。

鉴于CD8+Tex几乎只存在于IA_act患者的SFMC中,提取了IA_act组中SFMC来源的CD8+Tex,并将其进一步细分为4类(C1–C4)以探究其潜在的异质性(图5f)。有趣的是,CD8+ Tex-C1以终末耗竭标记物(PDCD1、ENTPD1、HAVCR2、TOX)的高表达为标志,而CD8+ Tex-C4以祖细胞耗竭标记物(PDCD1、TCF7、IL7R、SELL)的高表达为标志(图5g)。结果显示,CD8+ Tex-C4对祖细胞耗竭信号显示出显著更高的活性。相反,CD8+ Tex-C1在末端耗尽信号中显著富集(图5h)。

虽然循环CD8+ T细胞的细胞比例在IA_act组和RA组之间没有差异,但确定了两组之间循环CD8+ T细胞的不同衰竭状态,表明存在与IA_act相关的衰竭亚群(图5d)。因此,对循环CD8+ T进行亚群分析,分为4个不同的聚类(C1–C4)(图5i)。值得注意的是,与IA_act相关的CD8+ T循环-C3和CD8+ T循环-C4(图5j),其终末衰竭信号的活性评分显著升高(图5k)。与CD8+ Tex-C1相似,CD8+ T循环-C4的特征是CXCL13、TOX、IFNG、CCL3和CCL4的高转录表达(图5l),并表现出由MKI67表达指示的更强的增殖能力(图5m)。因此,自我更新的祖细胞耗尽的CD8 Texs(CD8 Tex-C4)和增殖的CD8 Texs(CD8 T cycling-C4)都可能促进PD-1-IA的发病机制。

5 PD-1-IA患者SFMCs中CD8+ T细胞耗竭的异质性模式

6.IL1Bhi髓样细胞通过CCR1-CCL5/CCL3和CXCL10-CXCR3轴协调细胞通讯

通过细胞通讯分析表明,在滑液中,PD-1-IA组的髓样细胞与T细胞的相互作用比RA组强得多(图6a)。通常,在外周血中,PD-1-IA组中细胞因子/趋化因子和受体的相互作用对超过RA和HC组中的相互作用对,并且IA_act组中的数量略高于IA_rem组(图6b)。主要的细胞因子/趋化因子-受体对是CCR1-CCL5/CCL3和CXCL10-CXCR3(图6c)。作为CCL5和CCL3的受体,与RA和对照组相比,CCR1在IA_act的滑膜CD11b+巨噬细胞和外周CD14+单核细胞中的表达也更高(图6f–h)。体外趋化性试验证实,在CCL5治疗下,IA_act患者的外周单核细胞表现出跨孔迁移增加(图6i)。此外,在IA_act患者中观察到单核细胞向CD8+ T细胞的迁移增加,并且通过CCL5阻断减弱了这种增强的迁移(图6j-k)。因此,作者证明 CCR1-CCL5/CCL3 和 CXCL10-CXCR3 是PD-1-IA患者中 IL1Bhi 髓系细胞和CD8+ Texs之间的关键信号对。

6 CD8+ Texs和IL1Bhi髓系细胞之间的串扰

 

结论

作者报告了对PD-1-IA患者、RA患者和健康个体的外周血和SF中免疫细胞的全面单细胞分析,确定了与PD-1-IA相关的疾病特异性细胞群。发现IL1Bhi巨噬细胞和CD8+ Texs可能在PD-1-IA的发病机制中起着关键作用,为这种疾病提供了见解(图7)。

7 本研究的图形摘要




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