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送样建议

三代微生物产品

声明:
实验室不接收《人间传染的病原微生物名录》(点击查看)的所有样品。对于高毒性动植物等样品,必须事先通过销售、客服或运营经理与J9九游会技术人员联系,确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
提取风险提示和注意事项:核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系,尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响,因此较难保证单次提取满足质量要求,客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸,请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本,建议自行提取。取样过程中,需要全程佩戴手套,并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒,以免样本污染

1. 三代微生物

  • 1.1 单菌组织样本(细菌,真菌)

    • (1)样本量:菌体≥3g,-80℃保存,干冰寄送。
      (2)样本准备:对数期细菌(50ml)菌液,4000×g 离心 10min(4℃),弃上清,沉淀(离心后至少3g)用无菌水洗 2 次后干冰送样,建议送 2-3个平行,避免一次提取不成功。
      真菌(100mL)菌液,4000×g 离心 10min(4℃),弃上清,沉淀用无菌水洗 2 次后干冰送样,若是新鲜真菌建议 3g 以上,建议送 2-3个平行,避免一次提取不成功。
      (3)提取成功的样品类型:鲍曼不动杆菌,沃氏葡萄球菌,肠炎沙门氏菌,埃希氏菌,粪肠球菌,葡萄球菌,不动杆菌,放线菌,链霉菌等。
      (4)注意事项:
      a)甘油保存,需要重新液体培养基(例如 LB)活化到对数期,不可直接送甘油保存的菌株;
      b)不建议送固体培养皿的菌,如是只有固体培养基才能活,可以刮到有 PB 缓冲液的离心管里面,离心,送沉淀 2g 以上;
      c)真菌(5g)大型菇类等,建议送菌丝,不建议送孢子或是子实体,杂合率较高,不利于组装;
      d)样本一定为非灭活样本,灭活会导致核酸严重降解。
  • 1.2 三代扩增子组织样本

    • (1)样本量:
      样本类型 建议送样量 最低送样量
      土壤/污泥/沉积物/腐殖质 3-5g 1g
      水体滤膜 (孔径0.22-0.45μm/直径3-4cm) 2-3张 1张
      拭子 3-5个 1个
      瘤胃液/发酵液/组织液 (离心有明显沉淀) 3-5mL 1mL
      粪便/肠道内容物 3-5g 1g
      动物/人组织 1-3g 1g
      血浆 3-5mL 1mL
      (2)样本运输:-80℃保存,干冰寄送。
      (3)提取成功的样品类型
      项目类型 样本类型
      16s 土壤、粪便、淤泥、人和动物组织样本、水体、酒糟(发酵液)、棉签拭子、瘤胃液、菌体
      18s 土壤、粪便、淤泥、水体、酒糟(发酵液)、藻类
      ITS 土壤、粪便、淤泥、沉积物、人和动物组织样本、水体、酒糟(发酵液)
  • 1.3 三代宏基因组组织样本

    • (1)样本量:
      样本类型 建议送样量 最低送样量
      土壤/污泥/沉积物/腐殖质 6g 2g
      水体滤膜 (孔径0.22-0.45μm/直径3-4cm) 6张 2张
      空气滤膜 (直径种类多,与采样器搭配,有明显颜色沉淀在滤膜上) 6张 2张
      拭子 10-20个 6个
      瘤胃液/发酵液/组织液/冲洗液 (离心有明显沉淀) 6-10mL,沉淀2g 2mL,沉淀1g
      粪便/肠道内容物 5g 2g
      动物/人组织 2g 1g
      牛奶/酸奶 100mL/100g 20mL/10g
      食糜 4g 2g
      食品表面拭子 20个 10个
      (2)样本运输:-80℃保存,干冰寄送。
      (3)提取成功的样品类型: 土壤、水体、粪便、肠道内容物、发酵液等。
  • 1.4 核酸样本(微生物)

    • 1.4.1 单菌DNA送样量要求

      (1)纯度要求:OD260/280=1.8~2.0,DNA 条带单一,无杂带,无 RNA、蛋白质等杂质污染; (2)样品浓度和总量要求:
      产品 送样量
      PB单菌 浓度≥70ng/μL,总量≥5μg
      ONT单菌 浓度≥60ng/μL,总量≥6μg
      (3)细菌和真菌 DNA 样本,请老师首先进行污染排查检测和物种鉴定,污染排查和物种鉴定方法:细菌可以扩增 16s 全长后送一代测序,真菌还需扩增 ITS全长,确定物种正确,无其他杂菌污染再送样。
      (4)注意事项:
      ①菌液应当为对数生长时期;
      ②霉菌和蕈菌可能存在二倍体杂合度比较高的情况,而且也可能包含其他杂菌,如果直接提取 DNA 送样,会影响后续染色体组装效果,建议先进行纯化培养,多传几代,可以取孢子分离纯培养,然后再提取 DNA 送样。
    • 1.4.2 三代扩增子DNA送样量要求?

      • 1.4.2.1 DNA样本

        (1)样品浓度:DNA≥10 ng/μL,总量:DNA≥150 ng;
        (2)需客户提供电泳图;
        (3)送样时请使用干冰或冰袋运送(建议用干冰);
        (4)DNA 要有明显主带,无降解,无 RNA、蛋白质等杂质污染,例如如下电泳图:
        注:图中标为标准品,上样5μL(10ng/μL);M-1为Trans 2k plus,上样2μL;M-2Trans 15k plus,上样2μL;白色数字为样本序列号,原液上样5μL。
      • 1.4.2.2 PCR样本(包cell)

        (1)PCR产物浓度≥20 ng/μL,PCR 产物总量≥2μg(支持1次文库构建);
        (2)PCR产物要经过纯化(如胶回收纯化),确保条带单一,无降解,无引物二聚体;
        (3)PCR 产物需带有双端Barcode序列(注意区别于二代barcode序列,每个样本有成套barcode序列);
        (4)需客户提供电泳图;
        (5)送样时请使用干冰或冰袋运送。
    • 1.4.3 三代宏基因组DNA送样量要求

      (1)样品总量:DNA浓度 ≥80 ng/μL,DNA总量≥5 μg(nanopore平台)或 DNA总量≥10 μg(Pacbio平台);
      (2)纯度要求:OD260/280=1.8-2.0,无 RNA、蛋白质等杂质污染;
      注:三代样本1为pass类样本,脉冲场电泳,主带在30K以上,基因组轻微断裂,轻微降解。
      (3)注意事项:人或动物组织样本宏基因组,要避免宿主DNA的污染,如果宿主基因组序列占环境DNA比例较高,测序后得到的有效数据量很低,且我们无法通过已知宿主基因组序列去污染,会对后续分析结果造成较大影响。建议可通过以下方法尽量避免宿主DNA的污染:
      ① 取样时,尽量不要取靠近组织的部位;
      ② 提取时,采用适用于样本类型的 DNA 提取试剂盒;
      ③ 如果宿主有参考基因组,可以通过比对去除宿主基因组污染。
    • 1.4.4 样本检测方法

      (1) Invitrogen Qubit?Fluorometer
      (2) Agarose Gel Electrophoresis
      (3) NanoDropTM/酶标仪
      (4) Agilent 2100 Bioanalyzer
    • 1.4.5 样本检测使用量

      样本类型 Qubit? AGE Agilent 2100 NanoDropTM/酶标仪 稀释度
      DNA样品 1-3μL 100ng或5μL(低浓度样品) 1.5-3μL 1-2μL 如样品浓度 >= 200ng/μL 将用TE缓冲液稀释原液
    • 1.4.6 DNA样本质控说明

      DNA样本质量图示。
      (1)质量好的DNA样本(推荐):
      (2)质量差的DNA样品(不推荐): DNA样本风险文库构建风险:
      1. 总量不足:可能导致 a. 文库构建失败;b. 文库产量低不能上机测序或测序数据量不足;c. 影响文库随机性;d. 导致数据产量和覆盖度偏低;
      2. 样品降解(尤其基因组样品):影响覆盖均一性和随机性;可造成duplication偏高等。
      3. 含有杂质样本:可能造成文库构建失败,建议纯化后送样。

2 样本打包及寄送建议

  • 2.1 样本的打包

    (1)核酸样品建议使用质量好的1.5ml或2ml 低吸附EP管装载样品,并用封口膜封口。为了防止样品管破裂,或者污染和混乱,请不要使用诸如PCR管、0.5ml EP管、八联管、96孔板、深孔板等非标准管送样。非标准管不利于样品保存以及后续实验的进行。如有样品使用非标准管制备,还请在送样前自行转管处理。
    (2)组织样本建议根据送样量使用合适规格带螺纹帽的EP管、冻存管或者离心管装载组织样品,并用封口膜封口。
    (3)为防止样品管在运输过程中受到干冰挤压破裂,最好将样品管放到50ml离心管或其他支撑物中,并在支撑物里添加棉花或卫生纸缓冲。大量样品建议将EP管放置在冻存盒中,并在冻存盒外面包裹气泡垫。如使用锡箔纸、自封袋装载的样品,为防止运输中受挤压破损,建议将锡箔纸折叠整齐装在自封袋中,在样品包装外再用气泡垫包好并固定。
    (4)对于血液样品,建议采用5-10ml 塑料抗凝采血管装载,为了防止运输过程中采血管因挤压而损坏,需要将每支采血管管身均用气泡垫包好,然后放置到塑料或纸质包装盒中。
    (5)用乙醇沉淀的样品由于运输中会有少量乙醇挥发出,建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈。
    (6)为便于处理和保存,组织样品送样量请不要超过建议送样量的5倍(特殊的得率较低的样品除外)。
  • 2.2 样本的名称标识

    (1)所有的样品必须具有清晰的标记,并且简洁明了。
    (2)使用锡箔纸包装的组织样品建议在锡箔纸内外均标记样品名称,并将锡箔纸放在自封袋中,自封袋外面再标记上样品名称,防止锡箔纸上样品名称模糊引起样品混乱。
    (3)使用乙醇沉淀的核酸样品,由于挥发出的乙醇会使记号笔的标记模糊,建议用油性记号笔将样品名称写在标签纸上,然后用透明胶带将标签纸粘贴在样品管壁上,并缠绕2-3圈。
    (4)样品名称建议使用“字母+数字”命名方式标注在管盖。其他信息如日期、浓度、物种等可标注在管壁。所有标注内容需与《样品信息单》保持一致。

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